科學家們借助高通量單細胞轉錄組測序技術，在發育生物學、腫瘤微環境、疾病研究等領域取得了豐碩的研究成果，揭示了單個細胞基因表達的特點，解讀了細胞異質性的奧秘。隨著研究的深入開展，越來越多的機制需要被揭秘，對技術的要求越來越高。為給廣大科研工作者提供更好的技術服務，安諾優達特推出全新的解決方案 10x Flex，該技術可解鎖更豐富的樣本組織類型，實現更高數量級細胞的同時解析，進行更精準的胞內轉錄本信息鎖定，現在和小編一起來了解一下這個技術吧！
01 產品概述
10x Flex（原10x Fixed RNA）使用4%的多聚甲醛（PFA）對樣本進行固定，鎖定細胞的瞬時表達狀態。隨后，運用探針雜交的方法，捕獲基因，并展開建庫測序和分析工作。
圖1 Flex的實驗流程
每個探針對都包含左臂和右臂兩部分，左臂包含LHS（紫色探針）和pRead 2S結構。右臂包含RHS（黃色探針）、Constant Seq 、Probe Barcode和pCS1結構。其中pRead 2S用于連接測序儀上的flowcell，LHS和RHS用于結合靶向mRNA，Probe Barcode用于區分樣本來源，pCS1用于連接Gel Beads上的Oligo序列。
圖2 Flex的探針結構
02 產品優勢
批次效應降低
對于獲取時間不規律的腫瘤樣本、發育生物學中同一來源不同時間點的樣本、治療預后相關的臨床樣本等場景中樣本分批次采集的情況，可以應用Flex同批次進行雜交建庫實驗。實驗梯度設置更準確，同時降低結果可變性。
瞬時表達情況鎖定
對于異質性較強，生物學狀態快速變化的樣本，其細胞離體后，可能會受到較多外界壓力和影響，Flex經過PFA及時固定，已經鎖定了樣本瞬時的表達狀態。非常適合瀕死樣本、多階段變化樣本、脆弱樣本、需先進行病理分型的樣本等。
低表達基因檢測靈敏度提升
Flex運用了探針捕獲原理，人基因組pancel覆蓋18,082個基因（53,444探針對），小鼠基因組pancel覆蓋19,059個基因（55,128探針對）。大部分的基因設計3組探針對；對高表達的基因（7.5%），僅設計1組探針對；對部分低表達的基因，設計5組探針對。保證常規基因檢出的同時提升低表達基因檢測靈敏度。
采集運輸難度減小
采集方面，樣本的及時固定，可使取樣更靈活，擴散到多個采集點的同時減少取樣時間限制。運輸方面，長距離運輸的壓力變小，也適合多中心合作的應用場景。
大規模實驗成本下降
特異性的探針（Probe Barcode）高達16種，單通道最高可實現16種樣本128,000個細胞的同時捕獲，8通道最高可實現百萬級細胞同時運行分析，大大降低實驗成本。
03 樣本和服務類型
安諾優達Flex目前可進行轉錄組層面的分析，由于實驗運用了探針捕獲原理，可接入物種僅限人和小鼠。
可接收的樣本類型包括單細胞懸液、單細胞核懸液、細胞系、凍存細胞、凍存組織、血液、新鮮組織、FFPE樣本，八大樣本類型均可兼容。
04 數據展示
根據Flex和3’轉錄組的實測對比數據結果，在多個樣本類型中，相同的測序數據量下，Flex所得的測序數據飽和度更高，探針靈敏度更強，單個細胞內可以檢測到的基因數更多。
圖3 血液樣本、癌癥樣本、細胞系樣本中Flex和3’轉錄組的實測對比結果
在人PMBC樣本的進一步分析中，對比固定后立即運行（Day 0）、在-80°C存儲1個月、在4°C存儲1周，三種情況下細胞的基因表達情況。PMBC中主要細胞類群仍呈現較為穩定狀態，并未伴隨固定時間不同出現顯著變化。
圖4 三種固定條件下PBMC中主要細胞類型的比較
05 常見問題
1. Flex的測序數據量和樣本注意事項？
Flex測序數據量至少為20k readspairs/cell。實際送樣時，在細胞大小方面，安諾可接收常規直徑≤30μm的細胞，理論支持直徑≤40μm的細胞。建議老師選擇來自同一組織來源的樣本。需進行混樣建庫的樣本，各樣本的測序數據量保持一致。
2. Flex有沒有什么特異性的應用場景？
常規3’轉錄組在進行解離時，可能會失去某些脆弱的細胞類型，而Flex可真實地深入研究特定的細胞類型。例如老師只想研究樣本中的中性粒細胞，可通過先組織固定后進行解離的方法，拒絕組織偏好性，盡可能還原樣本的原始狀態。
3. Flex能不能進行細胞核層面研究？
Flex可通過樣本由細胞懸浮液制備成核懸浮液的方式進行核內轉錄組研究。不能進行組織抽核研究。
4. 混樣細胞數上升是否顯著提高Flex雙胞率？
Flex的捕獲率和雙胞率都比較穩定，細胞一個GEM攜帶不同來源的細胞可通過探針區分，其攜帶的雙胞率不會隨樣本數而提升，捕獲1,000個細胞的雙胞率約為0.8%。捕獲8,000個細胞的雙胞率約為6.4%。
5. 分批采集的樣本可以同時進行Flex實驗，具體來看，樣本在何種條件下怎樣保存呢？
Flex固定后的樣本在4℃可儲存一周；在-20℃/-80℃最多可儲存3個月。樣本雜交后也可以在-20℃/-80℃最多儲存1個月。因此，建議樣本取樣后先行固定，確定好最終分選建庫的樣本后，統一完成后續的雜交建庫等工作。
